Análisis filogenético de cepas Venezolanas del virus de la encefalitis equina del este / Phylogenetic Analysis of Venezuelan Strains of the Eastern Equine Encephalitis Virus

Se realizó un estudio molecular de cinco cepas de virus de encefalitis equina del este (VEEE) mediante secuenciación de productos obtenidos en el ensayo de transcriptasa reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, por sus siglas en inglés). Secuencias de ~ 500 pb de la región 3’ no traducible del genoma se compararon con secuencias homólogas variantes Sur Americana (SA) y Norte Americana (NA) del complejo VEEE. La cepa EE VE02 EL PAO, con la cual se desarrolló una vacuna inactivada oleosa tuvo más similitud con la cepa EE VE76 EL DELIRIO, seguida por EE VE75 CATATUMBO,  EE VE96 MLLANO y EE VE84 TUCACAS respectivamente. La alineación de secuencias entre las cepas típicas reveló diferencias de 2,82 a 8,48 %. En tanto que, la cepa EE VE02 EL PAO difirió en un 8,86 % de la de Perú (EE PE-0,0155 del linaje III) y en un 38,08 % de la de EEUU (EE-PE-6 del linaje I, usada en vacunas comerciales). Los resultados indican que las cepas autóctonas tuvieron más similitud con la cepa SA, que con la NA. Se han identificado cuatro principales linajes en el complejo de VEEE (I-IV). El árbol filogenético evidenció dos clado: uno que agrupa los linajes I-III y el otro, el linaje IV. La mayoría de las secuencias están contenidas en el primer clado que, a su vez, se separa en dos grupos que contienen secuencias del linaje I y secuencias de los linajes  II-III y, debido al valor bootstrap alto (99%), los grupos se consideran completamente distintos. Sin embargo, éste no es el caso del grupo que contiene a los linajes II-III porque éstos se separan sólo el 53% de las veces, pero se asume que las cepas venezolanas pertenecen al linaje III dividido en dos subclados: IIIA y IIIB.

A molecular study of five strains of the eastern equine encephalitis virus (EEEV) was conducted by sequencing of products generated using the reverse transcriptase assay, coupled to the polymerase chain reaction (RT-PCR). Sequences of approximately 500 pair of bases from the non-translated 3’ region of the genome were compared with homologous sequences of the South American (SA) and North American (NA) variants of the EEEV complex. The EE VE02 EL PAO strain, used to develop an inactivated oil vaccine had most resemblance with the EE VE76 EL DELIRIO strain, followed by the EE VE75 CATATUMBO, the EE VE96 MLLANO and the EE VE84 TUCACAS strains, respectively. The alignment of sequences among typical strains revealed differences of 2.82 and 8.48%, respectively, while the EE VE02 EL PAO strain differed in 8.86% from the Perú strain (EE PE-0.0155, from lineage III) and in 38.08% from the NA strain (EE-PE-6, from lineage I, used in commercial vaccines). The results of the present investigation indicate that the autochthonous strains have more similarly with the SA strain than with the NA strain. Four major lineages (I-IV) in the EEEV complex have been identified. The phylogenetic tree evidenced two clades, one which groups lineages I-III and another, lineage IV. Most of the sequences are contained in the first clade, which at the same time, separates into two groups containing sequences of lineage I and lineages II-III; and, due to the high bootstrap value (99%) the groups are considered completely different. However, this was not the case of the group which enclosed the lineages II and III; because these only separate 53% of the time, but it is assumed that the Venezuelan strains belong to linage III, which diverges into two subclades: IIIA and IIIB.

Cuantificación relativa de genes relacionados con la respuesta inmune antiviral en una población venezolana de Aedes (stegomyia) aegypti / Relative quantification of Antiviral immune response related genes in an Aedes (stemgoyia) aegypti Venezuelan population

El virus DENV-3 es el responsable del segundo mayor porcentaje de afecciones hemorrágicas severas causadas por este virus, solo superado por el virus DENV-2. La virulencia de este serotipo, causante de brotes epidémicos a gran escala en países como Venezuela donde circula activamente durante todo el año, es la razón principal del desarrollo investigativo en el campo de las interacciones virus-vector en la búsqueda de un control epidémico efectivo. En el presente trabajo, se evaluó la expresión de dos genes, RNAi (dcr-2 y ago-2), que codifican para proteínas de respuesta antiviral en mosquitos con la finalidad de estudiar el cambio en la expresión de los mismos en el vector una vez infectado con el DENV-3. Para ello, se infectó artificialmente una población de Aedes (stegomyia) aegypti de Trujillo, elaborándose dos grupos experimentales (15dpi y 20dpi) y un control; posteriormente se aisló, cuantificó y se realizó transcripción reversa al RNA total aislado de los grupos. La infección en los grupos experimentales se evidenció por la detección de bandas de productos de PCR de 511pb para DENV y 290pb para DENV-3 mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, y se realizó la cuantificación relativa de la expresión genética por PCR en tiempo real. Como resultado, la expresión de los genes no presentó cambios con respecto a los mosquitos no infectados (grupo control) (p<0.05). Estos resultados indican que el virus DENV-3 pudiera estar mostrando mecanismos de evasión sobre las vías de RNAi dentro del cuerpo del vector, y esto puede estar relacionado al hecho de que la replicación de los miembros del genero Flavivirus, entre ellos el DENV, se lleva a cabo en el sistema de membranas y vesículas, lo que les permite evadir el encuentro en el citoplasma con las proteínas asociadas al complejo de RNAi.

DENV-3 is the responsible for the second major percentage of hemorrhagic severe affections caused by this virus, only overcome by DENV-2. The virulence of this serotype is the cause of broad scale fever outbreaks in different countries, especially in Venezuela where it circulates actively throughout the year. This is the main reason of investigative developments in the virus-vector interactions field to find an effective epidemic control. In this study, we evaluated the expression of dcr-2 and ago-2, two RNAi antiviral pathway genes in mosquitoes to study the fold change in the expression of these genes in the mosquito vector Aedes (stegomyia) aegypti infected with DENV-3. We artificially infected a population of mosquitoes from Trujillo state (Venezuela) and prepared three (3) experimental groups (15dpi, 20dpi and a control group). Later, we isolated, quantified and applied a reverse transcription to the total RNA obtained of mosquitoes and the infection in the experimental groups was detected performing a 2% agarose gel electrophoresis of the PCR products of the total RNA (511bp for DENV and 290bp for DENV3). In addition, the infection in the experimental groups was confirmed by the detection of PCR products. The fold change in dcr-2 and ago-2 expression genes was quantify by Real Time PCR. As results, the fold change expression in the ago-2 and dcr-2 were equal to the non-infected mosquitoes “control group” (p<0.05). These results indicate that DENV-3 could have evasion mechanisms of RNAi pathway inside vector’s body, and this can be related to the fact that dengue virus replication is accomplished in the vesicle system and membrane system as well (endoplasmic reticulum and golgi complex) avoiding cytoplasmic encounter with the RNAi pathway proteins.

Population genetic structure of the dengue mosquito Aedes aegypti in Venezuela

The mosquito Aedes aegypti is the main vector of dengue in Venezuela. The genetic structure of this vector was investigated in 24 samples collected from eight geographic regions separated by up to 1160 km. We examined the distribution of a 359-basepair region of the NADH dehydrogenase subunit 4 mitochondrial gene among 1144 Ae. aegypti from eight collections. This gene was amplified by the polymerase chain reaction and tested for variation using single strand conformation polymorphism analysis. Seven haplotypes were detected throughout Venezuela and these were sorted into two clades. Significant differentiation was detected among collections and these were genetically isolated by distance.